新規創薬への期待が高まる　高輝度蛍光ナノ粒子PIDによる新しい蛍光イメージング

有機蛍光色素の集積により高輝度化

こうして2010年度から2014年度に実施されたNEDOプロジェクト「がん超早期診断・治療機器の総合研究開発／超早期高精度診断システムの研究開発：病理画像等認識技術の研究開発」で、「高輝度蛍光ナノ粒子／PID（Phosphor Integrated Dots）」（詳細は「なるほど基礎知識」参照）を用いた、高輝度で定量的、退色し難い、病理組織の蛍光イメージング技術の開発が、コニカミノルタと東北大学の共同研究により進められました。

開発の対象となった「蛍光イメージング技術」は、病気などの指標タンパク質に蛍光の目印（この場合はPID）を付け、指標タンパク質の量や分布を調べるのに使われる技術です。この技術を使った多くの場合、指標タンパク質の量は、光学装置が検出する「蛍光強度値」を基に算出されていました。しかし、この値は光学装置によって変わってしまうため、目標とする「定量性」を実現するには問題がありました。

そこで、権田教授は指標タンパク質の量を、PIDの「蛍光強度値」ではなく「粒子数」の単位で算出する、という方法を発案しました。PIDの粒子数は、光学装置の影響を受けずに算出できるため、絶対量として扱うことができます。この概念は、共通の病理診断基準を作ることにもつながると期待されました。

PIDの粒子数を正確に算出するためには、1粒子の蛍光輝度が非常に高く、なおかつ粒子径が均一なPIDを開発しなければなりませんでした。というのも、蛍光輝度が低いとノイズとなる蛍光（組織由来の自家蛍光）が邪魔をして、指標タンパク質をはっきりと捉えられず、また、粒子径にばらつきがあると、各粒子の蛍光強度にブレが生じ、粒子数の算出が困難になるためです。どのような性質のPIDができるかは、その作り方によるため、緻密な検討を重ねました。

PIDは無機物でできた球形の外殻に、数万分子の有機蛍光色素が高密度に詰まった構造をしています。PIDを作るには、溶液の中でまず、無機物でできた外殻を形成させ、そこに有機蛍光色素を入れ込むように操作します（写真1）。

写真1　クリーンルーム内で行われるPID粒子作製作業（再現イメージ）

最初に試作したPIDは、シリカ（SiO₂）で作った外殻の中に、ある有機蛍光色素を集積させました。粒子径は比較的揃っていましたが、輝度も耐光性も十分ではありませんでした。第二世代では、外殻のシリカを変更し、有機蛍光色素も輝度の高いものに変えましたが、今度は粒子径が揃いませんでした。

このように外殻については4種類の材料の組み合わせを変えるとともに、そこに集積させる有機蛍光色素は、数十種類を試しました（写真2）。さらに反応温度や試料の添加タイミングもPIDの性能を左右するため、微調整を重ねました。

写真2　PID製造工程の一部。試料の添加（左）、計量（中）、加熱（右）。製造の最適条件を見つけるために試行錯誤を繰り返した

高橋さんは、「外殻の製造方法や製造条件を見出すのには苦労しました」と語ります。「プロジェクトでは、権田教授のアドバイスを基に、組織由来の自家蛍光の影響を最小限にとどめるため、自家蛍光が強い波長域から離れた、赤色の蛍光波長のPIDを開発していましたが、最初に試作した粒子は蛍光色素が外殻から漏れやすくて悩まされました」（高橋さん）

膨大な数の製造条件を検討した結果、外殻とその中身となる有機蛍光色素の最適な組み合わせを見つけ出し、病気の指標タンパク質が少量でも可視化できるほど、輝度と耐光性が高く、粒子径も揃ったPIDの開発に成功しました（写真3、4）。

写真3　（左）PIDの電子顕微鏡像。粒子径が均一になっている（写真提供：コニカミノルタ）。　写真4（右）製品化された赤色蛍光PID。紫外線照射で強い蛍光発光が見られる

高橋さんは言います。「粒子径を揃えるには界面活性剤の働きを上手く利用しました。また、弊社の銀塩写真用粒子を揃える技術が、PIDに使えることもわかりました」

定量的な蛍光イメージング技術を実現

続いてコニカミノルタはPIDを使い、「定量的」に病気の指標タンパク質を把握するための蛍光イメージング技術の構築に取りかかりました。

当初、指標タンパク質の定量は、PIDの蛍光の輝点数を測定して行っていました。しかし、輝点は複数のPIDが一塊になっていても1輝点となってしまうため、指標タンパク質の量を正確に反映できないという問題がありました。高橋さんは、「1点に見える輝点でも10倍明るければ、そこにPIDが10個あるはずなのです。定量性の確立には、明るさとPID数の関係の理論化が必要でした」と説明します。

高橋さんは一つの試料について、蛍光顕微鏡によるPIDの蛍光像と、それとは別に電子顕微鏡によるPIDの粒子像を撮影して、両者を統合し、蛍光強度と粒子数の関係で検量線を作ってみることにしました（図1）。

図1　電子顕微鏡像と蛍光顕微鏡像、そこから作成した検量線。PIDの1粒、1粒が確認できる。検量線からは、PIDの粒子数と蛍光強度が比例相関するとわかる　（資料提供：コニカミノルタ）

電子顕微鏡像には、PIDが1粒1粒はっきりと写っていました。これを計数し、蛍光顕微鏡で観察される蛍光強度が、粒子数と比例相関していることを明らかにしました。この結果をもとに、PIDの蛍光信号から病気の指標タンパク質の量をPIDの粒子数として定量的に評価する、独自の解析ソフトウェアも開発しました（写真5）。

写真5　PIDを使ったイメージング画像からPIDの個数を自動算出するソフトウェアも開発。（左）操作イメージ、（右）算出結果

乳がんの病態組織の詳細な分類に成功

PIDの実用化が現実味を帯びてきた2012年頃、それが実際に医療現場で使えるかを検討するために、東北大学とともにプロジェクト内で取り組んだのが、東北大学関連の8病院が保有していた85検体の乳がん針生検試料の染色でした。

この検証は、大内教授、東北大学大学院医学系研究科 乳腺・内分泌外科の石田孝宣准教授（現：教授）、多田寛講師（現：准教授）、宮下穣助教（現：講師）らの尽力による患者標本の選定・収集や倫理委員会での承認取得、そして、渡辺准教授によるDAB染色を施した従来法での診断の確認や、医療現場で実際に行う手技で作成される組織切片の準備といった、万全な協力体制があって実現しました。

高橋さんは、「東北大学の先生方のアドバイスに基づき、すでに確定診断と治療が行われ、その予後もわかっている患者さんの検体を染色して、従来の染色法との比較を行いました」と説明します（写真6）。

写真6　（左）PIDで染色された細胞、（右）プレパラートに固定された細胞の染色作業　（いずれも再現イメージ）

染色のターゲットとしたのはHER2タンパク質です。これは乳がんの分子標的薬「トラスツマブ」の投与を判断する際の指標になります。HER2タンパク質の染色結果について、従来の「DAB染色」ではHER2の量を3＋、2＋、1＋、0の4段階で区別していたのに対して、PIDを用いると従来法では区別できないような濃度領域の区分が可能であることが明らかになりました（図2）。

図2　DAB（1＋）染色よりもPID染色の方がHER2タンパク質の発現量を詳細に捉えられる　（資料提供：コニカミノルタ）

こうしてコニカミノルタは、東北大学大学院医学系研究科や東北大学病院の病理診断技術開発の研究メンバーの協力によって、高輝度かつ高耐光性のPIDの開発に成功し、その応用として、実際の医療現場でも適用可能な、高い感度と定量性を実現した病理組織の蛍光イメージング技術を構築・確立しました。

NEDOプロジェクトから得た気付き

中野さんたち開発メンバーはプロジェクトの中で、NEDOからいくつもの気付きがもたらされたと言います。中野さんは、「プロジェクトの最終目標がPIDの開発だけでなく、病理組織イメージングシステムの構築になったのも、NEDO側から提案を受け、実際に医療現場で使えるシステムを構築しなければ、PIDには価値がないことに気付かされたからです」と説明します。

中野さんは続けます。「私が『次はこういう風に考えている、あれをやろうと思っている』と伝えると、NEDOは非常に良く理解してくれました。3カ月毎に行われる報告会は大変でしたが、そこでの議論も『がんを治す』という、プロジェクト関係者全体が共有する目標へ向けて、実用化へのモチベーションの維持につながったと思います」

また高橋さんは、「外部的な視点でいろいろ指摘いただいたのが大きかったと感じています」と話します。NEDOがプロジェクトの良き理解者であり、時に適切な助言をしたことが、中野さん、高橋さんら、実際に研究開発を続けるメンバーの背中を強力に後押しました。

日仏共同研究でPIDの新たな価値の創出に挑戦

NEDOプロジェクト中盤の2012年4月、NEDOからプロジェクトメンバーに「フランスのパスツール研究所関連のベンチャー企業から研究者が来日するので会わないか」という連絡が入りました。

同年3月に開催された日仏のバイオ関連企業のビジネスマッチングイベントで、パスツール研究所と同研究所発のベンチャー企業であるバイオアクシャル社が共同研究先を探していたことを受けて、共同研究先としてマッチしそうな国内のバイオ関連企業などに、NEDOが声がけをしていたのです。中野さんはその知らせを聞いて、「世界的な研究所と一緒に何かできるとは思ってもみなかったですが、何があるかわからないので、取りあえず会ってみることにはしました」と言います。

NEDOによる橋渡しをきっかけに、両者間での情報交換が始まりました。パスツール研究所はかねてからコニカミノルタのPIDの性能の高さに注目していたこともあり、面会後もたびたび情報交換は続き、2013年12月には技術交流が始まりました。「そのようなタイミングで、NEDOから『パスツール研究所と共同研究をするなら、日仏コファンド事業を利用してはどうか』と提案されました」と中野さんは言います。

コファンド事業とは、日本企業と優れた技術を持つ外国企業とが、共同で国際研究開発プロジェクトを実施する際に、NEDOと相手国の支援機関が並行して、それぞれ自国企業の研究開発費用の一部を支援するものです。

中野さんは言います。「これにはパスツール研究所とバイオアクシャル社もたいへん喜んで、いろいろな研究テーマの提案がありましたが、『創薬に向けて、生きた細胞の動態を詳細に見る』というテーマに、PIDを使って挑戦することにしました」

創薬研究の過程では、医薬品の作用を正確かつ詳細に解析する必要がありますが、その一つの方法として「生きた細胞をイメージングする技術」が注目を集めていました。その技術にPIDを組み合わせ、生きた細胞内部での医薬品の動きや影響を詳細に調べることで、医薬品候補の効能をより正確に評価できるようになると考えてのことです。

こうしてコニカミノルタはパスツール研究所とバイオアクシャル社とともに「国際研究開発／コファンド事業／フランスBpifranceとの国際研究開発・実証事業」（2015～2017年度）に応募し、採択されました。

コニカミノルタはこの事業の中で、生きた細胞を染色できるPIDを新たに開発し、細胞内での医薬品の動態を観察することに成功しました。また、超解像顕微鏡システムを活用し、高精度な観察技術の基盤となるソフトウェアの開発にも貢献しています。これらの成果がその後のコニカミノルタの創薬支援ビジネスにつながっています。

NEDOが橋渡しした日仏機関の関係、そして中野さんをはじめとした開発者のチャレンジ精神がPIDの新たな活用先を開拓したのです。