滑膜由来の間葉系幹細胞の大量培養による再生細胞治療実現に向けて

無血清培地の材料選定に悪戦苦闘

無血清培地の開発に加え、ツーセルでは、1人から採取した細胞で複数人分の培養ができる「他家（たか）移植」にも取り組みました。

これまで細胞の移植などによる治療では、患者自身の細胞を採取し、培養して移植する「自家（じか）移植」が一般的でした。しかし、自家移植では一度に1人分の製剤しか作製できない、という問題がありました。

加藤副社長は、他家移植の重要性をこう指摘します。「自家移植では、細胞の採取から培養まで数カ月かかり、コストも高くなります。一方、他家移植は、培養が2週間から1カ月ですみ、大量に低コストで生産し、しかもすぐに病院で使えるので、再生医療の産業化には不可欠な方法と言えます」

しかし、他家移植を採用したことは、開発スタッフにとって大きなプレッシャーでした。

開発の中心的な役割を担ったのは邵研究本部長と長谷川森一研究本部副本部長（兼gMSC®センター長）でした。長谷川さんは、「私は入社7年目ですが、入社当時、他家移植には懐疑的でした。他家移植では拒絶反応が強いため、実現は難しいと思ったのです」と言います。

「加藤副社長や邵研究本部長は、無血清培地をゼロから開発した方ですので、知識量が私たちとは格段に違うのです。それに追いつくのが大変で、9カ月ほど経ってからようやく無血清培地の扱い方が分かりました」（長谷川さん）

長谷川さんは、「体内に入れるものを製造する培地ですから、材料の採取先から加工までトレースできるクオリティの高い材料に変更していきました」と話します。

「しかし、調達先が国内にはなく、海外から購入するしかなかったのですが、調べていくと、その大本となる原料メーカーは一つのベンチャー企業でした。その品質証明がなかなか取れずに、確認できるまで相当な時間を割くことになりました」（長谷川さん）

調査先は欧米から中国、中東にまでおよび、サンプルを取り寄せるのに船便で送ってくるため2〜3カ月かかることもありました。しかも、材料はタンパク質なので熱で性質が変化してしまうときもあり、再度取り寄せるなど、さらに時間がかかりました。

受け取ったサンプルが培地として使えるか調べ、組成比率を変えて実験を繰り返しました。こうした作業に3年ほど費やし、最終的には11種類の材料を入れ替えて最適な無血清培地を作り上げました。

3年かけて80人のドナーの滑膜組織から培養実験を繰り返す

こうした培地作りと並行して、「ヒト幹細胞産業応用促進基盤技術開発」プロジェクトでは、滑膜由来MSCの増殖実験が行われました。

この工程は、どの患者（ドナー）の組織でも常に変わらない高品質のMSCを培養できることを証明するために行うもので、他家移植には必須でした。中村教授が、実験に同意してもらったドナーから滑膜組織を採取し、それをツーセルに送って、MSCの培養実験を繰り返しました。

実用化に向けて苦難を乗り越え大量培養のための「gMSC®センター」を開設

こうした土台となる実験が終わり、ツーセルは、無血清培地で滑膜由来他家MSCを培養して「TEC」を活用し、膝軟骨再生細胞治療製品のプロトタイプ製剤を完成させ「gMSC®1」と名付けました。

ツーセルは、さらに2014年からは、NEDOプロジェクト「イノベーション実用化ベンチャー支援事業」に参画し、「gMSC®1」の実用化で必要となる製剤化技術の開発に取り組みました。

その中で、「gMSC®1」の大量培養の実証実験を行うための施設として、「gMSC®センター」を新設しました。

再生医療製品は生きた細胞を製品とするため、製剤化後の滅菌処理が行えません。そのため、「gMSC®センター」は、無菌環境の中での滑膜組織の受け入れ・細胞培養・製剤化・パッケージング・出荷までの、工場にあるような一連の再生医療製品の生産工程を備えた施設として設置されました（写真2）。

製品の品質保証を担当する岩本佳央梨副センター長は、「『gMSC®センター』は、量産工場になぞらえて作られていますが、当時の体制は実証実験段階以上のものではありませんでした。培養作業だけでなく、記録や確認、承認などすべて自分たちで行います。大量培養の実験とは言え、限られた人数で対応しなければならず、苦労の連続です。しかし、この施設での実証実験で、今後に向けて何が足りなくて、何が必要か、それが分かったことは重要なことでした」と語ります。

「短期では成果の出ない地道な実験をNEDOが評価してくれました」

松本昌也治験推進室副室長は、当時の状況をこう語ります。「有血清培養では時間がかかる一方、無血清培養では時間も早く、品質も安定していることは分かっていましたが、実用化レベルでの大量培養となると、従来のラボレベルの量では見えていなかったいろいろな課題が出てきました」

実用化レベルでの大量培養では、生産量がラボレベルの10〜100倍にもなります。そのため作業時間が長くなり、細胞に与える影響も違ってきます。ラボレベルと同じことをやっていても結果が違ってしまうこともあり、その原因を追及して改善を繰り返すしかありませんでした。

松本さんは、「なにしろラボレベルでは起こったことがないことが起きるし、ミスも発生します。例えば継代培養では、細胞をはがすときに剥離剤を使いますが、大量培養での剥離剤の適切な量が分からず、突然、細胞の増殖が悪くなるのです。そんなことが起きるとは思っていないため、原因が分からず、それを突き止めるのに苦労しました」と話します。

「また、シャーレも大型化し、多量に使用するので、インキュベーターに入れると、棚がたわんでしまうのです。そのため、細胞を均一に蒔いたつもりでも、培養するとシャーレ中の細胞密度が変わってしまう。棚がたわんでいるなどとは思わないので、原因発見には苦労しました」（松本さん）

長谷川さんは、「大きな突破口があったというよりも、こうした小さな改善の積み重ねこそが大きなカギとなっていきました。地道な積み重ねと細かい実験の繰り返しは、短期的には大きな成果に見えません。しかし、NEDOがそうした地道な努力を評価してくれたからこそ、今があります」と言います。

「研究は成果重視の世界なので、地道な研究に予算は付きにくいのですが、NEDOプロジェクトでは、地道な研究を評価してくれるのがありがたかったですね。学会発表では結果がしっかり出ていないといけないことが多いのですが、NEDOプロジェクトは短期間では成果が出ない、継続取得中のデータに対しても適切な評価をいただけました。研究者としては逆に新鮮で、実用化に向かうには、こうしたサポートが必要なのだと感じました」（長谷川さん）

一方、岩本さんは、「NEDOのプロジェクトでの報告会を通して、実験方法を見直すことができました。私たちはベンチャーとして経験が浅いこともあり、NEDOのマネジメントによって、データの充実を図ることができました」と言います。

長谷川さんも報告会で、プロジェクト内の他グループの報告を聞けたことが役立ったと話します。「『ヒト幹細胞産業応用促進基盤技術開発』プロジェクトでは、機械工学的な知見も必要なのだということが分かり、タイムリーに情報共有できました」

こうしてツーセルは、プロトタイプ製剤を昇華させ、「gMSC®1」を臨床試験の段階に進めることができました。これは軟骨の再生を促す画期的な医療製品となることが期待されています。「gMSC®1」は、将来的には、一片の組織から理論上1,000〜1万人分の製剤が作製可能で、治療開始までの時間短縮や、大幅な治療費削減の実現が見込めます。

辻社長は、「長い時間がかかりましたが、ようやく軟骨の再生医療が現実になりつつあります。小さなベンチャーでは資金が続かなくて研究を進められないケースが多い中、当社は基礎研究から実用化まで続けることができ、支援をいただけたことをありがたいと思っています」と話します。

無重力状態で大量培養できる、画期的な装置「Gravite®」

再生医療の産業化を目指し結集した「ヒト幹細胞産業応用促進基盤技術開発」プロジェクトからは、「gMSC®1」の他に、「無重力下での大量培養技術」も開発されました。

「ヒト幹細胞産業応用促進基盤技術開発」が始まるときに、辻社長が参加を求めたのが、ツーセルと同じく広島大学発ベンチャー企業のスペース・バイオ・ラボラトリーズ（SBL）でした。

2005年に設立された同社は、広島大学の弓削類教授が開発した、重力環境を制御できる世界初の培養装置「Gravite®（グラビテ）」などの販売・開発活動を行っています。

もともと、ツーセルとSBLは、大学内の同じ建屋の中にあり、弓削教授と辻社長は親しい間柄でした。弓削教授は、「辻社長からは、MSCの大量培養に向けて、『Gravite®』を使えないかという話があり、NEDOプロジェクトに参加することになりました」と振り返ります。

「Gravite®」は、培養容器を二軸で回転することにより、360度全方位に重力を分散させ、中に入った試料にかかる重力を実質的に、1000分の1Gという微小重力（ほぼ無重力）から2〜3Gの過重力環境までを作り出すことができる画期的な装置です（写真4）。

プロジェクト参加以前から、弓削教授は微小重力下で幹細胞を培養すると、未分化性を維持したまま培養できること、さらには、微小重力で培養すると、天と地がなくなり、培養面積が大幅に増えるため、大量培養が可能になることを発見していました。

そこで弓削教授は、微小重力下で幹細胞を培養すれば、それを未分化状態のまま大量に培養でき、幹細胞の安定供給につながるとの着想のもと、「Gravite®」の開発を進めていました。しかし、NEDOプロジェクト参加以前の「Gravite®」には、培養装置としてはまだまだ改良すべき課題が残っていました。

そのためNEDOプロジェクトでは、ツーセルと共同で滑膜由来MSCの大量培養技術の開発を行い、「Gravite®」の改良を重ねていきました。

「Gravite®」は「gMSC®1」の完成に向けて、すぐにでも大きな威力を発揮すると予測されていましたが、培養容器と無血清培地の相性が良くありませんでした。「Gravite®」では、新たに開発された円筒形培養チューブに、折り畳んだフィルムを使用することで、大量培養を可能にしていました。しかし、無血清培地は培養容器表面の選り好みが大きく、一般的なフィルムでは、再現性をもって大量に培養することに難がありました。

SBL代表の河原裕美さんは、「通常のフィルム素材ではどうしても培養にムラができてしまい、その問題解決がなかなか困難でした」と話します。

「しかし、原因追及の経験は大きな財産になり、NEDOプロジェクト終了後も改良を重ね、ようやく昨年、無血清培地に合った高分子フィルムを発見して、培養が可能になりました」（河原さん）

「Gravite®」は2015年に販売を開始しました。最新バージョンでは、微小重力下では通常環境より約3倍速く増殖し、特別に開発した50mlの円筒形培養チューブを使うと、たった1本で直径10cmのシャーレ12枚分の培養面積を確保できます。

この独創的な装置はアメリカのNASAでも高く評価され、2016年にNASAケネディ宇宙センターに導入され、動物や植物細胞、タンパク質結晶化など多くの研究者が「Gravite®」を使った研究を行っています。また、国際宇宙ステーションでの予備実験にも使われています。

「『Gravite®』の開発は、NEDOの支援がなければできなかったでしょう。現在も、広島大学でツーセルと一緒に共同研究を続けており、MSCの大量培養の研究にも、すでに取り組んでいます」（弓削教授）